来源：生物制品圈

双特异性抗体与T细胞重定向

使用双特异性抗体分子进行T细胞重定向，是非常有前景的肿瘤治疗策略。

双特异性抗体，约50%为CD3靶向的双特异性抗体（BsAb），包括catumaxomab (Removab®, Epcam x CD3, Trion Research GmbH,approved in the European Union in 2009),衔接T细胞的双特异性抗体（BiTE）blinatumomab (Blincyto®, CD19xCD3,Micromet/Amgen, approved by the US Food and Drug Adiministration in 2015）。50kDaBiTE被设计成在一个多肽链中有两个单链可变片段(ScFv)结构域。此外，正在研究从纳米抗体(25 KDa)到IgG-融合(≥150 kDa)的多种形式。

虽然较小的分子具有连接细胞间距离较短的优点，并且可以显示更好的肿瘤穿透性，但需要进行Fc改造，通过FcRn介导的循环和调节Fc活性来控制血清的半衰期。 

T细胞杀伤活性需要形成免疫突触（ISs），是将T细胞链接到呈递有多肽-MHC复合物的目标细胞。激活的的免疫突触，导致释放的细胞毒性颗粒和细胞因子.由于空间邻近T细胞和靶细胞在ISs形成过程中，大分子如CD45被排除在膜间之外空间。这允许细胞间距离为15 nm，与IgG 1的Fab臂的距离大致相同。

使用BsAb的T细胞重定向需要模仿IS，这是通过与靶细胞表面抗原结合的CD3与靶细胞结合来桥接T细胞受体复合物来实现的。多种因素可以影响T细胞重定向活动，如靶向臂的差异亲和力，如CLL1xCD3 knob-in-hole IgG1BsAb的例子所示。MCSPxCD3 BiTE和FcRH5xCD3BsAb的表位结合距离也很重要。

在针对5T4膜近端结构域的T细胞上，在嵌合免疫受体(CIR)的胞外部分插入Fc-based linker也能增强T细胞的活化和靶细胞杀伤。相反，在没有Fc-based linker情况下，表达CIR时，针对CD19的T细胞被激活到更高的水平，但没有更有效地杀伤靶细胞。因此，结构特征，如与膜的抗原表位的可及性和距离以及bsAb的灵活性，对有效的T细胞重定向有重要影响。

IgG亚型结构差别

BsAb的IgG亚型也会由于可变区域展示、铰链序列和二硫键结构的变化而影响其功能活性。IgG的铰链区连接Fc结构域和Fab结构域，每个IgG亚类的长度、序列和二硫键结构各不相同。

IgG1具有较长的铰链区，有两个二硫键。IgG2的铰链区最短，也是最坚硬的，因为它存在于三个主要异构体中的四个二硫键。IgG4的铰链与IgG2的铰链区氨基酸长度相同（12个氨基酸），但含有更多的脯氨酸，而不是半胱氨酸残基，并且只有一个类似IgG1的二硫键结构。这些结构变化影响着IgG铰链区的柔韧性，IgG1>IgG4>IgG2。IgG1是柔韧性最好的（由电子显微镜观测）。用小角度X射线散射(SAXS)分析不同IgG亚bAb结构域的构象。IgG1分子是封闭Y、中间Y/T和广泛开放T构象的等量混合物。IgG4分子以Y/T构象为主，而IgG 2分子以Y构象为主。尽管IgG1、IgG2和IgG4亚型被用作治疗生物制剂的框架,IgG亚型对T细胞重定向的影响未详细研究。

IgG亚型对T细胞重定向研究

分子设计

Janssen BioTherapeutics的科学家，通过controlled Fab-arm exchange (cFAE)技术，建立IgG1，IgG2，IgG4三种亚型的CD3XCD19双特异性抗体。结合CD19膜远端结构域的亲本抗体是以人源化的blinatumomab（博纳吐单抗）为基础的，结合CD3e链的亲本抗体是基于OKT3的可变区。为了尽可能减少Fcγ受体（FcγR）的影响，采用Fc突变，减少其与FcγR的结合：IgG1 FES, IgG2 σ1and IgG4 PAA。

设计两个IgG亚型，将IgG1和IgG4的F（ab）2包含铰链区融合到IgG2 σ1-Fc (命名为 IgG1:2 σ1 and IgG4:2 σ1）。

所有亚型的蛋白质和细胞结合通过SPR和流式细胞术来进行。BsAb能将T细胞连接到其各自的靶细胞，并抑制靶细胞的增殖，以此评价其体外活性。

试验数据

1. 各亚型双特性抗体分子质量控制

RSV：specificity control

2. 各亚型BsAb和Fc受体的结合能力

FcRn结合不受影响，因而对药物血液半衰期没有影响。所有由IgG2σ1 Fc组成的分子与FcγRs相互作用最少。在抗体依赖细胞介导的细胞毒性、补体介导的细胞毒性和抗体依赖的细胞吞噬作用等多种体外功能试验中，IgG 2σ1与FcγRs的相互作用有限，在体外转化为低活性或无活性。

3. 各亚型BsAb和抗原、CD19B细胞淋巴瘤、T细胞结合力

HBL-1：CD19-expressing B-cell lymphoma lines (low CD19 receptor density(RD)

Daudi：(high CD19 RD)

所有分子单臂亲和力<3X范围内，表明IgG亚类和分子形式(抗体与BsAb)对体外亲和力均无显著影响。同样，CD19各IgG亚类细胞结合是平等的，与CD19RD和RFP-转导无关.由于二价IgGs比与BsAb的结合弱2-3倍，这些观察表明分子的亲和力很小。相反，CD3特异性BsAb结合T细胞的能力比他们的双价亲本抗体弱10倍，提示CD3的亲和力比CD19更强。这可能是由抗原本身驱动的，特别是特定的抗原表位，它们允许CD3的二价结合，而不是CD19的二价结合。

4. 各抗体亚型细胞聚合能力

5. 各IgG亚型抑制B细胞淋巴瘤增殖能力 

概括

双特异性抗体(BsAbs)介导的T细胞重定向是一种很有前途的肿瘤治疗方法。双重抗原结合对T细胞的重定向是必需的，并受依赖于其IgG亚类的BsAb的结构特性的影响。在本研究中，针对CD19xCD3的BsAb是在携带Fc突变的IgG1、IgG2和IgG4的变异体中产生的，它们减少了FcγR的相互作用（避免CDC，ADCC等副作用），两种嵌合IgG亚型为IgG 1：2和IgG 4：2，其中IgG 1-或IgG 4-F(Ab)2被嫁接在IgG 2 Fc上。含有IgG 2或IgG 4-F(Ab)2结构域的分子是结构最紧密的分子。所有的BsAb都被证明与它们的目标蛋白(和相应的细胞)结合得同样好。然而，CD19xCD3 IgG 2不能同时结合这两种抗原，这是由于T细胞没有与靶细胞聚集。这意味着IgG2 BsAb在T细胞重定向试验中的作用减弱.IgG 4：2和IgG 1：2嵌合亚型IgG2BsAb的活性完全恢复。这证实了F(Ab)2区对BsAb功能活性的重要贡献，表明不同Fc和F(Ab)2结构域的工程改造分子可以调控BsAb的功能。 

核心内容总结

IgG2型因为铰链区短且柔韧性差，如果整体双特异性抗体亚型为IgG2，则T细胞的重定向效果最差。但IgG2型Fc和FcγRs结合最弱，可以引起最小的毒副作用。

将IgG1和IgG4含铰链区的F（ab）2和IgG2的Fc段连接成嵌合分子，则可以将T细胞重定向和最小毒副作用两个优势结合在一起。并且减少使用突变技术改造Fc段，因为有研究报道突变，可以改变抗体药物的免疫毒性，引起临床毒性反应。采用IgG2天然的Fc段可以一定程度解决这个问题。 

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